پایان نامه زیست شناسی – طراحی و مدلبندی آنتی بادی scFv انسانی شده علیه hTNF-α و بررسی اینتراکشن آنها
چکیده – پایان نامه زیست شناسی
TNF-α یک سایتوکاین پیش التهابی است. که اساسا بوسیله ماکروفاژهای تحریک شده ترشح می¬شود تا سیستم های کنترلی درگیر در تکثیر سلولی، تمایززدایی، التهاب، مرگ و تنظیم ایمنی را فعال کند. گرچه سطح طبیعی TNF-α. برای تنظیم پاسخ های ایمنی بسیار مهم است.، اما افزایش سطح آن باعث التهاب ¬های مزمن، بیماری های خودایمنی و عفونت می¬شود. بنابراین هدف قرار دادن TNF-α. با استفاده از آنتی بادی ¬ها می¬تواند یک استراتژی درمانی موثر در کنترل و درمان چنین بیماری¬هایی باشد.
از سویی اغلب آنتی بادی¬های موجود علیه TNF. دارای عوارض جانبی گسترده¬ای می¬باشند. که پروسه¬ی درمان را با مشکل مواجه می¬کند، از این رو نیاز به طراحی و تولید آنتی بادی¬های جدید با کارایی بالاتر و عوارض جانبی کمتر ضروری به نظر می¬رسد.
قبل از تولید یک ترکیب دارویی جدید.، در ابتدا باید ساختار آن طراحی گردیده و فعالیت .و عملکرد بیولوژیکی آن ارزیابی گردد. عملکرد-های بیولوژیکی ماکرومولکول¬ها مثل پروتئین¬ها اساسا توسط ساختار مولکولی آنها تعیین می¬شود.
روش¬های تجربی مختلف مثل کریستالوگرافی اشعه X و رزونانس مغناطیس هسته¬ای.(NMR). ، برای توصیف و درک جزئیات اطلاعات ساختاری در سطح اتمی مورد استفاده قرار می¬گیرد.، اما استفاده از روش¬های فوق جهت بدست آوردن اطلاعات ساختمانی بیوماکرومولکول.¬ها بسیار مشکل. و مستلزم هزینه¬های گزاف است.
امروزه روش¬های محاسباتی مدلبندی مولکولی جهت پیش بینی و طراحی ساختار سه بعدی ماکرومولکول¬ها. بسیار مناسب بوده و اخیرا بسیار مورد توجه قرار گرفته است. شبیه سازی مولکولی پروتئین¬ها .و کمپلکس¬های پروتئین-پروتئین، اطلاعات مفیدی در مورد ساختار و برهمکنش¬های احتمالی ماکرومولکول¬ها بدست می¬دهد.
چکیده
هدف از این مطالعه ، پیش بینی ساختار سه بعدی برای کمپلکس¬های ایجاد شده بین TNF-α. و آنتی بادی¬تک زنجیره¬ای hD2 می¬باشد. هدف کلی این کار طراحی و مدلبندی یک آنتی بادی تک زنجیره(scFv) انسانی شده علیه hTNF-α. و بررسی اینتراکشن آنهاست.
مطالعه¬ی حاضر نشان داد که از بین مدل¬های ایجاد شده یرای آنتی بادی hD2 توسط الگو¬های مختلف.، مدلی که براساس الگوی توالی پروتئینی مربوط به 2GHW ایجاد شده،. بهترین انطباق را از لحاظ برهمکنش با نقاط اساسی و مهم در TNF-α(اسیدآمینه های مناطق 141-148) نشان می¬دهد.
همچنین نتایج Ala-scanning نشان داد جهش در هر کدام از اسیدآمینه¬های. مهم hD2 در برهمکنش با TNF-α باعث بهبود ساختار کمپلکس. TNF-α- hD2نشد. همچنین جهش زایی به اسیدآمینه¬هایی به غیر از آلانین نشان داد که فقط تبدیلF Y27 . باعث کاهش انرژی آزاد و افزایش پایداری ساختمان کمپلکس hD2-TNF-α. می گردد.
کلمات کلیدی
مدلسازی مولکولی , عامل نکروز تومور آلفا , ژن اس سی اف وی , پادتن , آنتی بادی تک زنجیره ای , فاکتور نکروز دهنده تومور , آنتی بادی تک زنجیره
فهرست مطالب
عنوان……………………………………………………………………………………………………………………………………….. صفحه
چکیده……………………………………………………………………………………………………………………………………………….یک
مقدمه…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….I
مروری بر مطالعات گذشته………………………………………………………………………………………………………………………II
فصل اول: کلیات
1-1) سایتوکاین ها………………………………………………………………………………………………………………………………..2
TNF-α (2-1………………………………………………………………………………………………………………………………………….3
1 -2-1) ژن کدکننده TNF-α ……………………………………………………………………………………………………………..4
(2-2-1گیرنده¬های TNF-α……………………………………………………………………………………………………………….4
(3-2-1نقش بيولوژيكي TNF-α………………………………………………………………………………………………………..6
(4-2-1 مكانيسم عمل TNF-α…………………………………………………………………………………………………………..7
TNF-α (5-2-1نقش TNF-α در بیماری¬ها…………………………………………………………………………………………9
(6-2-1مهارکننده¬های TNF-α ………………………………………………………………………………………………………….9
(3-1مدل¬بندی مولکولی………………………………………………………………………………………………………………………..11
(1-3-1مدل¬بندی مقایسه ای ساختار پروتئین…………………………………………………………………………………….11
(2-3-1اهمیت مدل¬بندی مقایسه ای…………………………………………………………………………………………………12
(3-3-1مراحل مدل¬بندی مقایسه ای…………………………………………………………………………………………………..13
(1-3-3-1جستجو برای الگو¬ها………………………………………………………………………………………………….14
(2-3-3-1انتخاب الگو……………………………………………………………………………………………………………..15
(3-3-3-1همردیفی ما بین توالی پروتئین های الگو و هدف…………………………………………………………..15
(4-3-3-1ساخت مدل……………………………………………………………………………………………………………..16
(5-3-3-1ارزیابی مدل………………………………………………………………………………………………………………16
(4-1محاسبه انرژی آزاد پیوند (Binding Free Energy)……………………………………………………………………………………..17
(5-1شبیه سازی دینامیک مولکولی…………………………………………………………………………………………………………………..17
(6-1 انطباق مولکولی……………………………………………………………………………………………………………………………………..19
فصل دوم: مواد و روش¬ها
2-1) سرورها و برنامه¬های مورد استفاده در این مطالعه……………………………………………………………………………………….22
BLAST (1-1-2…………………………………………………………………………………………………………………………..22
Amber (2-1-2…………………………………………………………………………………………………………………………….22
Swiss model (3-1-2…………………………………………………………………………………………………………………….24
VMD (4-1-2……………………………………………………………………………………………………………………………….25
Clustal W (5-1-2…………………………………………………………………………………………………………………………25
Protein Data Bank (6-1-2……………………………………………………………………………………………………………26
2-1-7) MolProbity……………………………………………………………………………………………………………………..26
2-1-8) PROCHECK…………………………………………………………………………………………………………………26
(2-2جستجو و بررسی برای یافتن آنتی بادی تک زنجیره¬ای علیه TNF-α……………………………………………………………..26
(3-2انسانی کردن آنتی بادی تک زنجیره¬ای D2…………………………………………………………………………………………………27
(4-2انتخاب الگوی مناسب……………………………………………………………………………………………………………………………..27
(5-2مدل¬بندی مولکولی ساختار سه بعدیhD2 در Deep View………………………………………………………………………….27
(6-2بهینه سازی ساختارhD2 در AMBERنرم افزار …………………………………………………………………………………………27
(7-2انجام مطالعات Docking بین TNF-αو آنتی بادی تک زنجیره¬ای hD2………………………………………………………….28
(8-2محاسبه انرژی آزاد بین کمپلکس TNF-α-hD2…………………………………………………………………………………………..28
(9-2مطالعات Ala-Scanningبصورت in-silico………………………………………………………………………………………………29
فصل سوم: نتایج، بحث و پیشنهادات
3-1)
نتایج……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..31
3-1-1) انتخاب آنتی بادی تک زنجیره¬ای ………………………………………………………………………………………………31
3-1-2) انسانی کردن آنتی بادی تک زنجیره¬ای………………………………………………………………………………………..31
3-1-3) انتخاب الگوی مناسب………………………………………………………………………………………………………………32
3-1-4) پیش بینی ساختار سه بعدی hD2 با استفاده از الگوها……………………………………………………………………35
3-1-5) بهینه سازی مدل¬ها در Amber…………………………………………………………………………………………………..35
3-1-6) ارزیابی مدل¬ها…………………………………………………………………………………………………………………………39
3-1-7) محاسبه¬ی RMSD مدل¬ها………………………………………………………………………………………………………….45
3-1-8) مطالعات انطباق مولکولی…………………………………………………………………………………………………………..46
3-1-9) بررسی پیوندهای موجود در کمپلکس hD2-TNF-α……………………………………………………………..48
3-1-9) محاسبه انرژی پیوند برای کمپلکس hD2-TNF-α……………………………………………………………………….52
3-1-10) نتایج مطالعات Ala-Scanning………………………………………………………………………………………………..53
2-3) بحث…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….56
(3-3نتیجه گیری …………………………………………………………………………………………………………………………………………..60
4-3)پیشنهادات………………………………………………………………………………………………………………………………………………60
منابع……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..61